我的ChIP-Seq(1): FastQC报告解读

Posted 2023-04-19

参考技术A 新手，刚做完一个ChIP-Seq项目的分析，来记录一下，会分好几篇。

首先是下机数据fastqc之后会生成一个html格式的报告，根据报告可以看出自己数据的特点，便于之后clean的参数设置。以下是fastqc（v0.11.5）报告的内容说明（以自己的数据为例，经公司粗过滤后的下机数据）有网上搜索到的也有自己的体会：

基本信息

碱基质量，Fred值=-10*log10(p)；p为某碱基测错的概率，若quality是20则概率为0.01，一般集中在30-40；如图横轴代表位置，纵轴quality。红线表示中位数，蓝线是平均数，触须是10%-90%区间，黄色是25%-75%区间（此图没有）；若任一位置的下四分位数低于10或中位数低于25，报"WARN"；若任一位置的下四分位数低于5或中位数低于20，报"FAIL".

横轴是位置，纵轴是tile的index编号，热图颜色浅代表质量低。当某些tile出现暖色时，后续分析应把该tail测序结果全部去除。

这一模块是检查reads中每一个碱基位置在不同的测序小孔之间的偏离度，蓝色表示低于平均偏离度，越红则说明偏离平均质量方差越多，也就是说质量越差。如果出现质量问题可能是短暂的，如有气泡产生，也可能是长期的，如在某一小孔中存在残骸。问题不大。

横轴是质量Q值，纵轴是对应的reads数目。主要集中在高分，证明测序质量好。

所有reads每一个位置的碱基分布。纵轴为百分比。ATCG出现的频率应该接近，且没有位置差异，四条线应该平行且接近。当部分位置碱基的比例出现bias时，往往是有overrepresented sequence的污染。当所有位置的碱基比例一致的表现出bias时，即四条线平行但分开，往往代表文库有bias (建库过程或本身特点)，或者是测序中的系统误差。 当任一位置的A/T比例与G/C比例相差超过10%，报" WARN "；当任一位置的A/T比例与G/C比例相差超过20%，报" FAIL "。

红色是实际值，若出现双峰，则是混入了其它DNA。

测序仪不能分辨的碱基为N，若超过5%则WARN，超过20%则FAIL。

理论上每次测序仪测出的read长度一致，但由于建库等因素通常会导致一些小片段，如果报FAIL，表明此次测序过程中产生的数据不可信。未过滤之前如图一，clean之后会出现图二，越短的reads越少，不会正态分布。

序列完全一致的reads的频率。横轴表示重复的次数，纵轴表示重复的reads的数目（ 以unique reads的总数作为100%）。一般测序深度越高，越容易产生一定程度的重复序列。但是read越长越不容易完全重复（测序错误、偏差等原因），所以重复程度可能是低估的。

No。指有某个序列大量出现（fastqc的标准是0.1%以上）一般有在前面GC图能看出来。

横轴表示碱基位置，纵轴表示百分比。当fastqc分析时没有选择参数-a adapter list时，默认使用图例中的4种通用adapter序列进行统计。若有adapter残留，后续必须去接头。

某k个bp的短序列在reads中大量出现。fastqc默认的k=5，可以通过-k -- kmers参数更改，范围是2-10。出现图一这种情况的原因要么是序列本身重复度高，比如建库PCR的时候出现了Bias。或者adapter没有除干净。clean之后前几个碱基还有少数高频也没关系，不影响后续分析，可正常使用。

以上。

可以看出我这批数据质量还是很好的，其实可以直接比对，已经是公司粗过滤之后的。但是我选择了自己再过滤一遍，下一个笔记会讲。

2020-01-21 测序数据的质控和过滤

参考技术A 二代测序数据下机后一般为rawdata，这时候含有一些低质量测序数据和街头污染数据，我们要将低质量数据过滤掉获得cleandata用于后续分析；

Fastqc(用于测序数据质控)，
MultiQC（用于质控结果整合和解读）
Trimmomatic（用于测序数据修剪和过滤）

fastqc运行结果图：

运行结束后，每个fq.gz文件会产生两个文件，一个是zip压缩文件，一个是html文件，将所有样品的文件转移到新的文件夹中。
如，可以将所有的zip文件和html文件转移到名字为fastqc的文件夹中。

根据multiqc整合结果分析测序数据质量

从上图可以看出，前15个碱基含量分布异常，
因此我们要将前15个碱基修剪掉，同时过滤掉低质量数据（）