我的ChIP-Seq(1): FastQC报告解读

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篇首语:本文由小常识网(cha138.com)小编为大家整理,主要介绍了我的ChIP-Seq(1): FastQC报告解读相关的知识,希望对你有一定的参考价值。

参考技术A 新手,刚做完一个ChIP-Seq项目的分析,来记录一下,会分好几篇。

首先是下机数据fastqc之后会生成一个html格式的报告,根据报告可以看出自己数据的特点,便于之后clean的参数设置。以下是fastqc(v0.11.5)报告的内容说明(以自己的数据为例,经公司粗过滤后的下机数据)有网上搜索到的也有自己的体会:

基本信息

碱基质量,Fred值=-10*log10(p);p为某碱基测错的概率,若quality是20则概率为0.01,一般集中在30-40;如图横轴代表位置,纵轴quality。红线表示中位数,蓝线是平均数,触须是10%-90%区间,黄色是25%-75%区间(此图没有);若任一位置的下四分位数低于10或中位数低于25,报"WARN";若任一位置的下四分位数低于5或中位数低于20,报"FAIL".

横轴是位置,纵轴是tile的index编号,热图颜色浅代表质量低。当某些tile出现暖色时,后续分析应把该tail测序结果全部去除。

这一模块是检查reads中每一个碱基位置在不同的测序小孔之间的偏离度,蓝色表示低于平均偏离度,越红则说明偏离平均质量方差越多,也就是说质量越差。如果出现质量问题可能是短暂的,如有气泡产生,也可能是长期的,如在某一小孔中存在残骸。问题不大。

横轴是质量Q值,纵轴是对应的reads数目。主要集中在高分,证明测序质量好。

所有reads每一个位置的碱基分布。纵轴为百分比。ATCG出现的频率应该接近,且没有位置差异,四条线应该平行且接近。当部分位置碱基的比例出现bias时,往往是有overrepresented sequence的污染。当所有位置的碱基比例一致的表现出bias时,即四条线平行但分开,往往代表文库有bias (建库过程或本身特点),或者是测序中的系统误差。 当任一位置的A/T比例与G/C比例相差超过10%,报" WARN ";当任一位置的A/T比例与G/C比例相差超过20%,报" FAIL "。

红色是实际值,若出现双峰,则是混入了其它DNA。

测序仪不能分辨的碱基为N,若超过5%则WARN,超过20%则FAIL。

理论上每次测序仪测出的read长度一致,但由于建库等因素通常会导致一些小片段,如果报FAIL,表明此次测序过程中产生的数据不可信。未过滤之前如图一,clean之后会出现图二,越短的reads越少,不会正态分布。

序列完全一致的reads的频率。横轴表示重复的次数,纵轴表示重复的reads的数目( 以unique reads的总数作为100%)。一般测序深度越高,越容易产生一定程度的重复序列。但是read越长越不容易完全重复(测序错误、偏差等原因),所以重复程度可能是低估的。

No。指有某个序列大量出现(fastqc的标准是0.1%以上)一般有在前面GC图能看出来。

横轴表示碱基位置,纵轴表示百分比。当fastqc分析时没有选择参数-a adapter list时,默认使用图例中的4种通用adapter序列进行统计。若有adapter残留,后续必须去接头。

某k个bp的短序列在reads中大量出现。fastqc默认的k=5,可以通过-k -- kmers参数更改,范围是2-10。出现图一这种情况的原因要么是序列本身重复度高,比如建库PCR的时候出现了Bias。或者adapter没有除干净。clean之后前几个碱基还有少数高频也没关系,不影响后续分析,可正常使用。

以上。

可以看出我这批数据质量还是很好的,其实可以直接比对,已经是公司粗过滤之后的。但是我选择了自己再过滤一遍,下一个笔记会讲。

2020-01-21 测序数据的质控和过滤

参考技术A 二代测序数据下机后一般为rawdata,这时候含有一些低质量测序数据和街头污染数据,我们要将低质量数据过滤掉获得cleandata用于后续分析;

Fastqc(用于测序数据质控),
MultiQC(用于质控结果整合和解读)
Trimmomatic(用于测序数据修剪和过滤)

fastqc运行结果图:

运行结束后,每个fq.gz文件会产生两个文件,一个是zip压缩文件,一个是html文件,将所有样品的文件转移到新的文件夹中。
如,可以将所有的zip文件和html文件转移到名字为fastqc的文件夹中。

根据multiqc整合结果分析测序数据质量

从上图可以看出,前15个碱基含量分布异常,
因此我们要将前15个碱基修剪掉,同时过滤掉低质量数据()

以上是关于我的ChIP-Seq(1): FastQC报告解读的主要内容,如果未能解决你的问题,请参考以下文章

FastQC处理二代测序原始数据的质量结果解读

3、RNAseq(3)--对RNAseq测序数据的质量控制(fastqc)

Fastqc用腻了,来试下这个R包吧

二代测序的数据的分析——质量控制

2020-01-21 测序数据的质控和过滤

我的ChIP-Seq(4):MAnorm差异分析